Phasefocus | Ensayo de cicatrización de heridas de nueva generación

Introducción:

El ensayo de cicatrización de heridas es un procedimiento in vitro establecido que mide la migración celular en conjunto. La base de este ensayo es crear una región libre de células dentro de una capa confluente de células, ya sea mediante la creación de un rasguño al eliminar las células después de la adherencia o mediante la exclusión física de las células durante el cultivo. Una vez que se ha creado el área libre de células, se monitoriza el cierre de la herida mediante imágenes de células vivas. La medida de la migración celular colectiva de esta manera, replica la migración en lámina que ocurre en una variedad de procesos biológicos tales como, metástasis del cáncer, morfogénesis embrionaria y lesión tisular.

El sistema Phasefocus Livecyte se puede utilizar para obtener imágenes de células y analizar su comportamiento, tanto con población general como con células individuales. La naturaleza no invasiva de la medición (sin etiquetas, baja potencia de iluminación) asegura que las células no sean perturbadas y se comporten de una manera más natural durante un período de tiempo más prolongado.
Se trata de campos de visión muy grandes sin puntos de corte, lo que permite extraer métricas de población estadísticamente significativas (cierre de heridas, proliferación). Mientras que la naturaleza cuantitativa y de alto contraste de las imágenes permite caracterizar el comportamiento de una sola célula (parámetros morfológicos y motilidad). El sistema Livecyte genera un conjunto de información mucho mayor a partir de estos ensayos establecidos, en comparación con los métodos tradicionales, como el campo claro, la fluorescencia o las imágenes de contraste de fase.

Método de Aplicación:

Se sembraron células MDA MB231 a 5 x 105 células/ml en placas de 2 pocillos de inserto de cultivo Ibidi (Cat. 81176) para crear un espacio libre de células por exclusión. 24 horas después de la siembra, se retiró el inserto y las células se trataron con uncontrol (BSA al 1% \ HBSS) o con ácido lisofosfatídico (LPA) 50 µM. Se utilizó el sistema Phasefocus Livecyte para realizar imágenes de la herida en intervalos de tiempo, cada 10 minutos, durante un período total de 48 horas. Se utilizó el software Phasefocus Cell Analysis Toolbox ™ (CAT) para segmentar y medir el área de la herida, a partir del cual se calculó el espacio t1 / 2 (tiempo para que el área de la herida se reduzca a la mitad) y Vmigration (tasa de migración celular). Además, las células individuales se segmentaron y se rastrearon para informar sobre la motilidad y los datos morfológicos.

Características:

• Mide directamente la motilidad celular.
• Diferencia entre la motilidad celular y la proliferación celular.
• Segmenta y rastrea celdas individuales a lo largo del borde.
• Caracteriza fenotipos celulares morfológicos y conductuales durante la cicatrización de heridas.

Resultados:

La tasa de cierre de la herida es la métrica más común que se mide a partir de un ensayo de cicatrización de heridas. Posteriormente, se puede calcular el t1 / 2 de la brecha y Vmigration. Se utilizó el sistema Livecyte para determinar con precisión el cambio en el área del espacio durante un período de 48 horas (Fig. portada). La adición de 50 μM de LPA hizo que la herida se cerrara a un ritmo más rápido (Fig.1 b) con un intervalo t1 / 2 de 21,4 horas y una Vmigración de 5,3 μM / hora en comparación con el control (41,9 horas y 2,5 μM / hora, respectivamente. Fig. 1 d, e.). Sin embargo, el cambio en el área del hueco puede verse influido tanto por la migración celular como por la proliferación celular. La naturaleza cuantitativa de las imágenes adquiridas permite la determinación del volumen óptico de las células. La medición del volumen óptico total de todas las células a lo largo del tiempo da una indicación de la tasa de crecimiento y proliferación celular. En este experimento, las células tratadas con LPA 50 μM aumentaron la tasa de proliferación celular después de 16 horas (Fig. 1c). Esto indica que después de las 16 horas, tanto la migración como la proliferación celular influyeron en el intervalo t1 / 2 y la migración V.

Además de modelar la migración colectiva, las capacidades adicionales del sistema Livecyte permiten la medición directa de células individuales en el borde delantero de la herida. El seguimiento de dichas células reveló un aumento en la velocidad media de las células y la velocidad instantánea de las células tras la aplicación de 50 μM de LPA. El tratamiento con LPA también indujo una reducción en el índice de meandros, revelando que el comportamiento de la migración también fue influenciado. Además de los parámetros de motilidad, la virtud de la segmentación celular individual permitió la cuantificación de parámetros morfológicos como el área celular, el grosor, la esfericidad y la relación longitud/ancho. El tratamiento con LPA 50 μM provocó un aumento en el grosor celular y la esfericidad, al tiempo que redujo la relación longitud/ancho.