Scanco | Análisis de la adiposidad visceral y subcutánea a través de MicroTomografía computerizada

Necesidad del cliente:

Para abordar la etiología y fisiopatología de la epidemia actual de obesidad y para evaluar los potenciales tratamientos, la cuantificación precisa del tejido adiposo es crítica.

El tejido adiposo total (TAT) no se distribuye uniformemente en el cuerpo, sino que se acumula en compartimentos específicos para convertirse en tejido adiposo visceral o subcutáneo. Los índices generales de obesidad que hacen un seguimiento del tejido adiposo total, como el Índice de masa corporal, no predicen con precisión el riesgo de diabetes y enfermedades cardiovasculares, porque la cantidad de grasa en los diferentes compartimentos corporales, acarrea distintos riesgos metabólicos.

El tejido adiposo visceral está más correlacionado con las patologías asociadas a la obesidad que el tejido adiposo total o subcutáneo. No es de extrañar que la eliminación de la grasa abdominal mediante liposucción no proporcione ningún beneficio a la salud, tal como debería esperarse de la reducción de la masa de grasa.

Todos los esfuerzos realizados para identificar mecanismos y tratamientos para la crisis sanitaria asociada con el síndrome metabólico han ido dirigidos hacia modelos con roedores (ratones y ratas). Las técnicas de imagen in vivo tienen el potencial para hacer una determinación más precisa del tejido adiposo, y permiten hacer un seguimiento del desarrollo de la obesidad y de la eficacia su tratamiento en el tiempo. Las imágenes de MicroCT no sólo cuantifican el volumen y geometría de los tejidos duros (como el óseo), sino de cualquier tejido con los gradientes de densidad suficientes (comparados con el background) incluídos depósitos discretos de grasa, e incluso se puede cuantificar infiltración de grasa en otros órganos corporales.

Como la resolución del MicroCT se puede seleccionar para que se encuentre en un rango isométrico de aproximadamente entre diez y doscientas micras, el sistema no sólo puede medir el volumen total de tejido adiposo dentro de un animal, sino que además puede identificar y cuantificar pequeños volúmenes de adipocitos, agregadas en pequeños depósitos discretos. Aquí se describe un método validado para extraer imágenes y cuantificar TAT (tejido adiposo total), SAT (tejido adiposo subcutáneo) y VAT (tejido adiposo visceral) mediante microCT in vivo.

Material y métodos:

Debajo se describen los pasos principales para la cuantificación in vivo de depósitos discretos de grasa mediante microCT para modelos de pequeños animales. Los parámetros de scanner y el uso efectivo de los análisis post-toma de datos que proporcionan la alta calidad de los mismos no se discuten aquí.

Todos los datos presentados se han generado con Scanco in vivo scanners VIVA CT 40 y VIVA CT 75.

• Ajustes de energía:

Cuando se toman imágenes de grasa, hay que hacer un gran esfuerzo en la optimización del contraste, comparado con la toma de imágenes de tejidos duros. Para nuestros escáneres, típicamente se selecciona la corriente más alta disponible para nuestra fuente (133 µA) y un voltaje bajo (45 kV). Los animales más pequeños o más grandes pueden requerir un ajuste en los parámetros de la energía del tubo, y eso puede requerir varios tests hasta encontrar los parámetros óptimos.

• Resolución:

Para minimizar el tiempo y los recursos necesarios para procesar y almacenar los datos, se seleccionará la resolución más baja que proporcione los detalles adecuados. Las densidades voxel para grasa son relativamente uniformes en todo el tejido adiposo, y los volúmenes parciales son menos importantes que para estructuras que tienen una arquitectura intrincada, como el hueso trabecular. La pared muscular abdominal se usa comúnmente para separar el tejido adiposo visceral (VAT, dentro de la cavidad abdominal) del subcutáneo (SAT, fuera de la cavidad abdominal). Para muchos de los ratones criados, se ha encontrado que una resolución de aproximadamente 80 µm es suficiente para identificar con precisión las fascia musculares de la pared abdominal.

• Región de interés:

Sólo un escaneado del cuerpo entero puede determinar el total de la grasa corporal; en cualquier caso, sería muy ventajoso en relación con el tiempo de escaneado y guardado de datos si se pudiera extraer información similar escaneando una región anatómica de menor tamaño. Con este fin, se realizaron escaneados de cuerpo entero a 45 ratones de 4 meses de edad, en un rango amplio de masas corporales y adiposidades, y se compararon los datos de varias regiones analizadas. La región más grande, abarcó casi el cuerpo entero, desde la base del cráneo, donde el canal espinal empieza a ensanchar, al extremo distal de la tibia [2]. La región más pequeña utilizó las mismas imágenes, pero el análisis se limitó a la región abdominal entre L1 y L5. Las grandes diferencias en masa corporal (rango: 15,7-46,5g) fueron inducidas mediante dietas diferenciales y una profilaxis no farmacológica para adiposidad en un período de 12 semanas. El volumen de grasa total resultó estar altamente correlacionado con el volumen abdominal de grasa en los 45 ratones analizados (Fig. 2). Estos datos indican que el escaneado de todo el ratón no tiene por qué ser necesario para obtener datos relativos de la grasa total, puesto que no había pérdida de información relativa debida a la restricción de la región de interés al volumen abdominal entre L1 y L5. Reduciendo el tamaño de la región de interés, se disminuía el tiempo de escaneado de aproximadamente 30-40 minutos a 12-13 minutos.

• Filtrado de datos, y umbrales:

El filtro de Gauss es el más comúnmente utilizado para reducir el ruido en las imágenes en escala de grises. Por nuestra experiencia, los niveles de sigma y el soporte 1.0 / 2 han funcionado bien para imágenes escaneadas a una resolución de 80 micras; habría que incrementar los valores a 1.5/3 para escaneados de 50 micras de resolución. Al filtrar, el umbral de la imagen facilita la segmentación del tejido de interés del fondo.

• Cuantificación automática de depósitos de grasa discretos:

Si bien la interpretación correcta de los datos de grasa en el metabolismo, la obesidad y la investigación relacionada con la diabetes pueden basarse en la evaluación volumétrica detallada de distintos compartimentos adiposos, también está claro que tales evaluaciones deben realizarse de manera precisa y eficiente. En las imágenes de TC, la pared muscular abdominal que separa la parte visceral del compartimento subcutáneo se puede usar como línea de demarcación para el VAT y SAT debido a la mayor densidad tisular del músculo [6]. Para separar los compartimentos de grasa de menor densidad a ambos lados de la pared muscular, la fascia se puede trazar manualmente dibujando líneas de contorno en cualquier corte microCT bidimensional dado.

Desafortunadamente, el dibujo manual de las curvas de nivel es engorroso, laborioso y puede no producir la precisión y exactitud deseadas. Los algoritmos semiautomatizados para separar la grasa visceral de la subcutánea son mucho más rápidos, pero pueden requerir la definición manual de un punto de siembra. Un algoritmo automatizado que es preciso y robusto fue desarrollado recientemente para cuantificar el VAT y el SAT en imágenes microCT [3]. El algoritmo está disponible para descargar en http://bme.sunysb.edu/labs/sjudex/miscellaneous.html y se basa en la detección de Canny [7] y las operaciones morfológicas matemáticas para automatizar el proceso de contorneado manual que de otro modo se requiere para delimitar espacialmente los diferentes depósitos adiposos.

Se utilizaron exploraciones microCT in vivo de 74 ratones C57BL / 6J con una amplia gama de pesos corporales y adiposidad para probar y validar el algoritmo [3]. A pesar de la alta heterogeneidad dentro de esta muestra de ratones, el algoritmo demostró un alto grado de estabilidad y robustez que no requirió cambiar ninguna de las variables de entrada establecidas inicialmente. Las comparaciones de datos entre los métodos automatizados y manuales estuvieron completamente de acuerdo (R2 = 0,99). La robustez se confirmó en un modelo de ratón de obesidad grave y en ratas. En comparación con el contorno manual, el aumento en la precisión y la precisión, al tiempo que disminuye el tiempo de procesamiento en al menos un orden de magnitud, sugiere que este algoritmo se puede usar de manera efectiva para evaluar por separado el desarrollo de la adiposidad total, visceral y subcutánea. Infiltración de grasa en otros órganos: Por supuesto, SAT y el VAT no son los únicos depósitos de grasa que pueden analizarse. El hígado y el bazo son dos órganos cuyos valores de densidad pueden medirse en una región transversal alrededor del disco intervertebral entre la 13ª vértebra torácica y la primera vértebra lumbar. La relación de densidad de hígado inverso a bazo (L / S) es un indicador del grado de infiltración de grasa en el hígado. Utilizando los métodos descritos anteriormente, se encontró que la proporción de LS era significativamente más baja en ratones C57BL / 6J alimentados con una dieta alta en grasas que en ratones de dieta normal, ambos a 8 meses (52,9%, p <0,0001) y 11 meses (69,5%, p <0,0001). de edad [3].

Validación del método:

Si bien hay pocas dudas de que la microCT puede cuantificar con precisión el volumen de grasa en función de las densidades de vóxel, la técnica descrita anteriormente se validó al comparar los datos de microCT volumétricos con un método bien establecido en la literatura. Se exploraron por micro-CT noventa ratones C57BL / 6J (rango de peso: 15,7-46,5 gramos) in vivo a los 5 meses de edad y se sacrificaron posteriormente. El volumen de grasa corporal total (desde la base del cráneo hasta la tibia distal) derivado de la microCT in vivo se correlacionó significativamente (p <0,0001) con el peso de tejido ex vivo perigonadal discreto (R2 = 0,94) y las almohadillas de grasa subcutánea (R2 = 0,91). Ambas correlaciones entre el peso de la almohadilla de grasa visceral y el volumen de grasa visceral determinado por microCT (R2 = 0,95, p <0,001) fueron muy altas (Fig. 4). Las fuertes correlaciones excedieron las asociaciones entre las mediciones de DXA y el peso de la almohadilla de grasa [8] y validaron el microCT in vivo como una técnica no invasiva y cuantitativa para determinar la distribución espacial de compartimientos de grasa específicos.

Conclusión:

Se describe un método validado que se puede usar para cuantificar depósitos de grasa discretos, así como la infiltración de grasa en órganos y tejidos de roedores pequeños vivos. En comparación con las técnicas de imagen actuales con capacidades similares, como microMRI o la combinación de DXA con RMN, microCT ofrece resoluciones espaciales más altas y puede estar más fácilmente disponible. La alta resolución del método permite la detección de la pared abdominal muscular que se utiliza para separar la adiposidad visceral de la adiposidad subcutánea. Se encuentra disponible un algoritmo que estandariza y automatiza el análisis de la distribución de compartimentos adiposos específicos. En resumen, in vivo microCT es una herramienta cuantitativa no invasiva que proporciona una alternativa eficaz, confiable, simple y rentable con mayor resolución y selectividad que muchos otros métodos para determinar con precisión los volúmenes adiposos totales y regionales y la infiltración de grasa en roedores pequeños.